? 在線(xiàn)前處理GPC-GCMS聯(lián)用技術(shù)測(cè)定奶粉及奶制品中的三聚氰胺
? 島津GCMS-QP2010 Plus測(cè)定奶粉及奶制品中的三聚氰胺
? SCX-C18混合填料色譜柱分析奶粉中三聚氰胺
? 反相離子對(duì)色譜法分析奶粉中三聚氰胺
? 乳制品中三聚氰胺的LC- MS分析測(cè)定
? 反相離子對(duì)色譜法檢測(cè)冰淇淋中三聚氰胺
? 奶粉中三聚氰胺新檢測(cè)方案
摘要 GPC凝膠凈化色譜和SPE固相萃取是目前在食品安全檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室常用的樣品前處理方式。在線(xiàn)GPC可以實(shí)現(xiàn)GPC凈化的在線(xiàn)完成，對(duì)乳制品中三聚氰胺的分析中能夠進(jìn)行較好的去除基質(zhì)，使衍生化進(jìn)行得更加徹底，檢測(cè)限可以達(dá)到0.01mg/kg。
關(guān)鍵詞 凝膠凈化色譜；氣質(zhì)聯(lián)用儀；三聚氰胺；前處理
1、實(shí)驗(yàn)部分
儀器條件和參數(shù)
島津在線(xiàn)前處理聯(lián)機(jī)系統(tǒng)GPC-GCMS
1.1 GPC條件：
流動(dòng)相：丙酮+環(huán)己烷＝3+7，流量0.1mL/min。進(jìn)樣量20uL。
1.2 GCMS條件：
色譜柱：DB-5ms （30m×250um×0.25um）；
柱溫：90℃，5min；15℃/min；190，0min；30℃/min；290，0min。
PTV進(jìn)樣口：120℃，5min；80℃/min；280，8min。5min后關(guān)閉分流閥。
質(zhì)譜條件：scan模式，掃描范圍m/z 86～400。SIM模式：m/z 342、327、328、171，定量離子m/z 342。
色質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2～6。
2、前處理方法
提取凈化方法參照NY/T 1372-2007。
取樣1～5g，按比例加入10倍量的二乙胺/水/乙腈=10/40/50(體積比)提取溶劑，混勻超聲提取，取約1.5mL混合液，10000rmp離心5min，準(zhǔn)確吸取1mL上清液過(guò)MCX（Waters，3cc，60mg）柱，依次用3mL水和3mL甲醇洗滌固相萃取柱，最后用3mL 5％氨化甲醇洗脫，洗脫液于70℃氮?dú)獯蹈伞０捶ㄑ苌?，最后用氮?dú)獯蹈裳苌噭?，加?mL流動(dòng)相（GPC）后GPC-GCMS測(cè)定，進(jìn)樣20uL。
如圖1，三聚氰胺TMS（3TMS）衍生物的GPC保留時(shí)間為3.29min（4min為溶劑峰），按儀器說(shuō)明書(shū)編制GPC-GCMS的GPC部分和GCMS部分的條件。
3、結(jié)果與討論
3.1 GPC在線(xiàn)前處理方法的優(yōu)勢(shì)
按NY/T 1372-2007（GC-MS法檢出限0.05mg/kg），取5g樣品，50mL提取液，最后取10mL（相當(dāng)于1g樣品）提取液過(guò)陽(yáng)離子交換柱凈化，很容易造成凈化柱堵住，且取10mL過(guò)柱后由于雜質(zhì)較多，衍生化的重現(xiàn)性很難做。本法只取1mL（相當(dāng)于0.1g樣品）提取液過(guò)陽(yáng)離子交換柱，液體流過(guò)很通暢，最后凈化效果與10mL樣品過(guò)柱比要好得多。
本方法檢出限為0.05mg/kg（相當(dāng)于0.1g樣品）。因?yàn)閮艋Ч^好，衍生后的定容體積可以到0.2mL，檢測(cè)限可以到0.01mg/kg（相當(dāng)于0.1g樣品）。
3.2 提取液的選擇
同時(shí)測(cè)試了美國(guó)FDA用于測(cè)定寵物飼料的方法，用甲醇提取奶粉中的三聚氰胺，回收率很低（小于10％），且提取液中糖的含量較高，影響最后三聚氰胺的衍生化產(chǎn)率。用其它有機(jī)溶劑提取的方法都存在糖對(duì)衍生化的干擾，最后都要用陽(yáng)離子交換的方法去除。
圖1 標(biāo)樣和樣品的GPC圖
圖2 40ng/mL三聚氰胺－3TMS（13.9min）標(biāo)樣SCAN模式下提取離子色譜圖和質(zhì)譜圖
圖3 100ng/mL三聚氰胺－3TMS標(biāo)樣（13.9min）SIM模式下提取離子色譜圖和質(zhì)譜圖
圖4 陰性樣品提取離子色譜圖（13.9min）
圖5 上述樣品加標(biāo)2mg/kg的提取離子色譜圖（回收率92％）
圖6 某奶粉樣品提取離子色譜圖（20mg/kg）
4、小結(jié)
本文使用了在線(xiàn)前處理聯(lián)機(jī)系統(tǒng)GPC-GCMS在奶制品中三聚氰胺的檢測(cè)中，不但減少了樣品分析的取樣量，減少前處理時(shí)溶劑的使用量，使樣品快速通過(guò)前處理柱，更好地去除干擾基質(zhì)，使樣品中目標(biāo)化合物衍生化時(shí)更迅速、完全，檢測(cè)的靈敏度更高，回收率結(jié)果滿(mǎn)意，檢測(cè)限可達(dá)到0.01mg/kg，滿(mǎn)足各行業(yè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)乳制品中三聚氰胺的分析檢測(cè)要求。
參照NY/T 1372-2007，使用島津的GCMS-QP2010 Plus測(cè)定了奶粉及液態(tài)奶制品中三聚氰胺的殘留。
氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀GCMS-QP2010 Plus
儀器設(shè)備
高速離心機(jī)（轉(zhuǎn)速可達(dá)到10000r/min以上）
漩渦混合器
超聲波清洗器
氮吹儀（控溫60℃以上）
固相萃取裝置及混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱
高速勻質(zhì)器
索氏提取器
震蕩搖床
GCMS方法儀器主要配置
主機(jī)：GCMS-QP2010 Plus（EI源）
自動(dòng)進(jìn)樣器：AOC-20i/s 或AOC-5000
色譜柱：Rtx-5ms 30m×0.25mm×0.25um（或同類(lèi)型）
NIST譜庫(kù)
GCMSsolution V2.5工作站（中文版或英文版）
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分析方法
對(duì)樣品進(jìn)行前處理，三聚氰胺用三氯乙酸溶液提取，經(jīng)混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱凈化后，用衍生化試劑（N,O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺BSTFA+1%三甲基氯硅烷T(mén)MCS）進(jìn)行衍生，用GCMS進(jìn)行定性分析和定量分析。檢測(cè)方法完全滿(mǎn)足目前三聚氰胺分析的要求。
載氣：氦氣
流速：1.3mL/min
進(jìn)樣量：1uL，不分流
進(jìn)樣口溫度：250℃
升溫程序：75℃（1min）-30℃/min-300℃（2min）
離子化方式：EI，70eV
離子源溫度：230℃
接口溫度：280℃
運(yùn)行時(shí)間：10.5min
Scan：60-400m/z
SIM：99、171、327、342m/z
標(biāo)準(zhǔn)樣品譜圖
三聚氰胺（Melamine）含氮量為66.6％，折合成粗蛋白含量為416.27%，加入寵物飼料和牛奶中可以大幅提高蛋白質(zhì)測(cè)定表觀(guān)含量，但食用后可誘發(fā)腎衰竭并導(dǎo)致死亡，因此一直禁止在飼料和食品中使用。2007年，國(guó)內(nèi)外發(fā)生多起寵物因食用添加了三聚氰胺的寵物食品而致死的例子，大量相關(guān)產(chǎn)品被召回。2008年9月，國(guó)內(nèi)發(fā)生奶粉中三聚氰胺導(dǎo)致嬰幼兒腎結(jié)石和腎功能衰竭甚至死亡的惡性事件。
目前對(duì)于三聚氰胺的檢測(cè)，最常規(guī)的方法為L(zhǎng)C方法。但由于該化合物含有三個(gè)有機(jī)氮基團(tuán)，極性強(qiáng)，在普通C18反相柱上難以保留，無(wú)法達(dá)到分離效果。文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的HPLC方法基本都須加入離子對(duì)試劑以增加三聚氰胺的保留，但辛烷磺酸鈉等離子對(duì)試劑恰恰限制了LC-MS的應(yīng)用。本文采用新型的SCX-C18混合填料色譜柱測(cè)定三聚氰胺，該柱內(nèi)填充的是均勻混合的SCX和普通C18填料顆粒，兼具離子交換和反相分離的特點(diǎn)，檢測(cè)中不需加入離子對(duì)試劑，還可應(yīng)用與LCsolution聯(lián)機(jī)，操作簡(jiǎn)便，靈敏度高。
儀器概況
本實(shí)驗(yàn)使用島津Prominence LC-20A高效液相色譜儀系統(tǒng)。LC-20A是島津制作所投入整體力量開(kāi)發(fā)的新一代高效液相色譜儀，具有以下特點(diǎn)：優(yōu)越的基本性能，輕松滿(mǎn)足客戶(hù)對(duì)儀器嚴(yán)格的要求；全自動(dòng)化操作，實(shí)現(xiàn)了分析的高效率；高度對(duì)應(yīng)網(wǎng)絡(luò)要求的綜合管理系統(tǒng)，改善分析工作環(huán)境。
本次實(shí)驗(yàn)所用儀器的具體配置為L(zhǎng)C-20AD輸液泵，DGU-20A3在線(xiàn)脫氣，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-20AC柱溫箱，SPD-20A紫外可見(jiàn)檢測(cè)器，CBM-20A控制器和LCsolution色譜工作站。
分析方法
色譜柱：CAPcell Pak CR(1:4) 4.6×150mm 5μm
檢測(cè)波長(zhǎng)：243nm
流動(dòng)相：15mM醋酸銨緩沖液(pH3.0):乙腈=7:3
流速：1.2mL/min
柱溫：30℃
進(jìn)樣量：10μL
洗脫方式：等度洗脫。
樣品前處理方法
取奶粉樣品0.5g，準(zhǔn)確加入5mL三氯乙酸溶液和0.2mL乙酸鉛溶液，搖勻，超聲提取20min。轉(zhuǎn)入離心管，在10000r/min離心機(jī)上離心5min，取上清液, 0.45μm濾膜過(guò)濾，上機(jī)測(cè)定。
分析結(jié)果
1.保留時(shí)間與峰形
圖1為本方法檢測(cè)三聚氰胺標(biāo)樣的典型色譜圖（樣品濃度為5ug/mL）
圖1 三聚氰胺標(biāo)樣圖譜
由圖1可見(jiàn)，本方法所測(cè)三聚氰胺保留時(shí)間為9.38min，峰形尖銳，對(duì)稱(chēng)性好。
2.精密度
取濃度為5μg/mL三聚氰胺標(biāo)樣，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果如表1所示。
| 編號(hào) | 保留時(shí)間(min) | 峰面積(μV.S) |
| 1 | 9.378 | 113178 |
| 2 | 9.388 | 112902 |
| 3 | 9.397 | 112677 |
| 4 | 9.397 | 112874 |
| 5 | 9.409 | 112909 |
| Average | 9.394 | 112908 |
| %RSD | 0.12 | 0.16 |
表1 保留時(shí)間與峰面積的重現(xiàn)性
由表1結(jié)果可見(jiàn)，本方法測(cè)定三聚氰胺具有良好的精密度和重現(xiàn)性。
3.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)
取標(biāo)準(zhǔn)品，用緩沖液稀釋成濃度為0.5μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別進(jìn)樣，得到校準(zhǔn)曲線(xiàn)(見(jiàn)圖2)。
圖2 校準(zhǔn)曲線(xiàn)
結(jié)果表明，該方法線(xiàn)性良好，相關(guān)系數(shù)為0.9999。
4.加標(biāo)回收率
取奶粉空白樣品，加入不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液，使奶粉中最終含量分別為0.5mg/kg、5mg/kg和50mg/kg，結(jié)果如下：
圖3 空白奶粉
圖4 空白奶粉添加0.5mg/kg三聚氰胺
圖5 空白奶粉添加5mg/kg三聚氰胺
圖6 空白奶粉添加50mg/kg三聚氰胺
加樣回收率結(jié)果如表2所示。
| 加樣量(mg/kg) | 計(jì)算結(jié)果(mg/kg) | 回收率 % |
平均回收率% |
| 0.5 | 0.55 | 109.3 | 115 |
| 0.60 | 120 | ||
| 5.0 | 4.56 | 91.2 | 92.9 |
| 4.72 | 94.5 | ||
| 50 | 48.6 | 97.2 | 97.8 |
| 49.2 | 98.4 |
表2 3個(gè)不同濃度樣品回收率
5.檢測(cè)限和定量限
用軟件計(jì)算出奶粉中三聚氰胺含量檢測(cè)限為0.43mg/kg ，定量限為1.31mg/kg。
6.實(shí)際樣品分析結(jié)果
按本方法測(cè)定某品牌的奶粉，得到的圖譜如圖7所示。兩份重復(fù)樣品中測(cè)得三聚氰胺的濃度分別為19.7和19.8mg/kg，重現(xiàn)性良好。(用反相離子對(duì)色譜法測(cè)得的兩次結(jié)果分別為19.1和19.2 mg/kg)
圖7 某品牌陽(yáng)性樣品檢測(cè)結(jié)果
結(jié)論
本方法定量限為1.31mg/kg，具有操作簡(jiǎn)單方便，靈敏度較高和重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。流動(dòng)相中不用加入離子對(duì)試劑，為L(zhǎng)CMS的分析提供了可能。且樣品經(jīng)提取后可不用經(jīng)過(guò)SPE步驟即可進(jìn)樣，大大簡(jiǎn)化了分析過(guò)程，節(jié)省了分析成本。本方法適合奶粉中三聚氰胺含量的測(cè)定，特別是大批量樣品的低成本快速檢測(cè)。
三聚氰胺（Melamine）簡(jiǎn)稱(chēng)三胺，學(xué)名三氨三嗪，別名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺。三聚氰胺含氮量為66.6％，折合成粗蛋白含量為416.27%，加入寵物飼料和牛奶中可以大幅提高蛋白質(zhì)測(cè)定表觀(guān)含量，但食用后可誘發(fā)腎衰竭并導(dǎo)致死亡，因此一直禁止在飼料和食品中使用。2007年，國(guó)內(nèi)外發(fā)生多起寵物因食用添加了三聚氰胺的寵物食品而致死的例子，大量相關(guān)產(chǎn)品被召回。2008年9月，國(guó)內(nèi)發(fā)生奶粉中三聚氰胺導(dǎo)致嬰幼兒腎結(jié)石和腎功能衰竭甚至死亡的惡性事件。
本文參考農(nóng)業(yè)部NY/T 1372-2007飼料中三聚氰胺測(cè)定方法中的樣品提取純化過(guò)程，采用反相離子對(duì)色譜法測(cè)定奶粉中三聚氰胺含量，重現(xiàn)性好，靈敏度高。
儀器概況
本實(shí)驗(yàn)使用島津Prominence LC-20A高效液相色譜儀系統(tǒng)。LC-20A是島津制作所投入整體力量開(kāi)發(fā)的新一代高效液相色譜儀，具有以下特點(diǎn)：優(yōu)越的基本性能，輕松滿(mǎn)足客戶(hù)對(duì)儀器嚴(yán)格的要求；全自動(dòng)化操作，實(shí)現(xiàn)了分析的高效率；高度對(duì)應(yīng)網(wǎng)絡(luò)要求的綜合管理系統(tǒng)，改善分析工作環(huán)境。
本次實(shí)驗(yàn)所用儀器的具體配置為L(zhǎng)C-20AD輸液泵，DGU-20A3在線(xiàn)脫氣，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-20AC柱溫箱，SPD-20A紫外可見(jiàn)檢測(cè)器，CBM-20A控制器和LCsolution色譜工作站。
分析方法
色譜柱：Inertsil C8 4.6×250mm 5μm
檢測(cè)波長(zhǎng)：235nm
流動(dòng)相：含10mM檸檬酸和10mM辛烷磺酸鈉的緩沖液(pH3.0):甲醇=7:3
流速：1mL/min
柱溫：40℃
進(jìn)樣量：10μL
洗脫方式：等度洗脫。
樣品前處理方法
參考農(nóng)業(yè)部NY/T 1372-2007飼料中三聚氰胺測(cè)定方法中的樣品提取純化過(guò)程，并進(jìn)行適當(dāng)修改，具體步驟如圖1所示。
圖1 前處理步驟
分析結(jié)果
1.保留時(shí)間與峰形
圖2為本方法檢測(cè)三聚氰胺標(biāo)樣的典型色譜圖（樣品濃度為1μg/mL）
圖2 三聚氰胺標(biāo)樣圖譜
由圖2可見(jiàn)，本方法所測(cè)三聚氰胺保留時(shí)間為11.02min，峰形尖銳，對(duì)稱(chēng)性好。
2.精密度
取濃度為5μg/mL三聚氰胺標(biāo)樣，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果如表1所示。
|
編號(hào) |
保留時(shí)間(min) |
峰面積(μV.S) |
|
1 |
11.016 |
214256 |
|
2 |
11.014 |
214205 |
|
3 |
11.014 |
214183 |
|
4 |
11.014 |
214292 |
|
5 |
11.013 |
214189 |
|
Average |
11.014 |
214225 |
|
%RSD |
0.01 |
0.022 |
表1 保留時(shí)間與峰面積的重現(xiàn)性
由表1結(jié)果可見(jiàn)，本方法測(cè)定三聚氰胺具有很好的精密度和重現(xiàn)性。
3.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)
取標(biāo)準(zhǔn)品，用緩沖液稀釋成濃度為0.5μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別進(jìn)樣，得到校準(zhǔn)曲線(xiàn)(見(jiàn)圖3)。
圖3 校準(zhǔn)曲線(xiàn)
結(jié)果表明，該方法線(xiàn)性良好，相關(guān)系數(shù)為0.9999。
4.加標(biāo)回收率
取奶粉空白樣品，分別加入不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液，使其三聚氰胺最終含量分別為0.5mg/kg，5mg/kg，結(jié)果如下：
圖4 空白奶粉
圖5 空白奶粉添加0.5mg/kg三聚氰胺
圖6 空白奶粉添加5mg/kg三聚氰胺
扣除空白奶粉后的加樣回收率結(jié)果如表2所示。
|
加樣量(mg/kg) |
計(jì)算結(jié)果(mg/kg) |
回收率 |
平均回收率% |
|
0.5 |
0.55 |
96 |
110 |
|
0.64 |
114 |
||
|
0.67 |
120 |
||
|
5.0 |
4.68 |
95.8 |
96.0 |
|
4.80 |
94.6 |
||
|
4.95 |
97.6 |
表2 2個(gè)不同濃度樣品回收率
5.檢測(cè)限和定量限
用軟件計(jì)算出奶粉中三聚氰胺含量檢測(cè)限為0.026mg/kg，定量限為0.079mg/kg。
6.實(shí)際樣品分析結(jié)果
按本方法測(cè)定某品牌的奶粉，得到的圖譜如圖7所示。兩份重復(fù)樣品中測(cè)得三聚氰胺的濃度分別為19.1和19.2mg/kg，重現(xiàn)性良好。
圖7 某品牌陽(yáng)性樣品檢測(cè)結(jié)果
結(jié)論
本方法定量限為0.079mg/kg，具有靈敏度高和重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，適用于奶粉中三聚氰胺含量的準(zhǔn)確測(cè)定，特別是低含量樣品的檢測(cè)。
三聚氰胺（Melamine）簡(jiǎn)稱(chēng)三胺，學(xué)名三氨三嗪，別名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺。三聚氰胺含氮量為66.6％，折合成粗蛋白含量為416.27%，加入寵物飼料和牛奶中可以大幅提高蛋白質(zhì)測(cè)定表觀(guān)含量，但食用后可誘發(fā)腎衰竭并導(dǎo)致死亡，因此一直禁止在飼料和食品中使用。2007年，國(guó)內(nèi)外發(fā)生多起寵物因食用添加了三聚氰胺的寵物食品而致死的例子，大量相關(guān)產(chǎn)品被召回。2008年9月，國(guó)內(nèi)發(fā)生奶粉中三聚氰胺導(dǎo)致嬰幼兒腎結(jié)石和腎功能衰竭甚至死亡的惡性事件。
本文建立對(duì)乳制品中三聚氰胺的單四級(jí)桿液質(zhì)分析測(cè)定方法，以電噴霧離子化方式正離子模式監(jiān)測(cè)，化合物的[M+H]+作為定量分析用的選擇性檢測(cè)離子,解決有時(shí)在液相分析時(shí)色譜分離不完全及定性信息不充分的問(wèn)題, 從而避免液相色譜紫外測(cè)定時(shí)樣品假陽(yáng)性情況。
1. 實(shí)驗(yàn)及方法
1.1 裝置概要
本實(shí)驗(yàn)使用Shimadzu LCMS-2010EV液相質(zhì)譜儀，C-20AD輸液泵，SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-20AC柱溫箱,含LC-20AD輸液泵，SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-20AC柱溫箱，DGU-20A3在線(xiàn)脫氣機(jī), LCMSsolution 3.20工作站軟件。
1.2 試劑
甲醇： 色譜純
乙腈： 色譜純
氨水： 濃度25%-28%
飽和乙酸鉛溶液
緩沖液：配制含10mM檸檬酸和10mM辛烷磺酸鈉的緩沖液，調(diào)節(jié)pH值到3.0
氨水甲醇溶液：量取5mL氨水，溶解于100mL甲醇中
1.3 樣品前處理
固體樣品取樣2g，液體樣品取樣5g，準(zhǔn)確加入9mL緩沖液溶液，加入1mL乙酸鉛溶液。搖勻，劇烈震蕩25min，10000r/min離心5min，取上清液。分別用3mL甲醇，3mL水活化混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱，加入2mL（液體樣品3mL）上清液上柱。依次用0.1mol/L鹽酸水溶液3mL水和甲醇3mL洗柱，抽近干后用氨水甲醇溶液3mL洗脫。洗脫液50℃氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)?0％乙腈溶解，0.45um濾膜過(guò)濾，上機(jī)測(cè)定。
1.4 分析條件
色譜柱：CAPCELL PAK CR（1:4） 4.6×150mm ,5μm；
流動(dòng)相：乙睛/10mM NH4Ac (50:50)，
冰醋酸調(diào)節(jié)混合液至pH=3；
流速： 1.5mL/min (約0.3mL/min進(jìn)質(zhì)譜)；
柱溫： 30℃；
進(jìn)樣量：10μL；
質(zhì)譜參數(shù)：電噴霧離子化ESI(＋)，
霧化氣: 1.5L/min，
干燥氣: 0.1MPa，
CDL 溫度：250℃，
加熱塊溫度：200℃，
檢測(cè)器電壓: 1.6 kV
2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.1 掃描方式結(jié)果見(jiàn)圖1及圖2
圖1 TIC (+)
圖2 SCAN (+) [M+H]+ m/z 127
2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)
三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱(chēng)取50mg（精確到0.1mg）的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，用70%乙腈溶液溶解并定容于100mL容量瓶中，該溶液濃度為0.5mg/mL。
稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液分別得到0.1μg/mL, 0.5μg/mL, 1μg/mL, 5μg/mL, 10μg/mL,50μg/mL分別進(jìn)樣，得到校準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖3所示。質(zhì)譜分析中選擇性離子監(jiān)測(cè)方式(SIM), m/z 127
圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)
標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程Y = 410,165.3X + 261,083.0 (Y- 峰面積) 相關(guān)系數(shù)為0.9996，線(xiàn)性關(guān)系良好, 檢出限為50ppb
2.3 標(biāo)準(zhǔn)品精密度數(shù)據(jù)
取濃度為1μg/mL三聚氰胺標(biāo)樣，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果如表1所示。
表1 保留時(shí)間與峰面積的重現(xiàn)性
由表1結(jié)果可見(jiàn)，本方法測(cè)定三聚氰胺具有良好的精密度和重現(xiàn)性。
2.4 樣品譜圖結(jié)果
實(shí)際樣品譜圖結(jié)果見(jiàn)下圖
圖4 空白液態(tài)奶
圖5 空白液態(tài)奶加標(biāo)準(zhǔn)品
3. 結(jié)論
單四級(jí)LCMS-2010EV分析乳制品三聚氰胺可以避免液相色譜紫外檢測(cè)樣品時(shí)假陽(yáng)性結(jié)果, 并且其成本比使用串聯(lián)質(zhì)譜分析低, 可以很好的滿(mǎn)足乳制品中三聚氰胺的分析測(cè)定要求。
摘要
對(duì)于許多食品，人們需要獲悉其中蛋白質(zhì)的含量，但是直接測(cè)定蛋白質(zhì)的含量比較困難，通常通過(guò)測(cè)定氮原子的含量來(lái)間接推算其中蛋白質(zhì)的含量。三聚氰胺（含氮量66%)與蛋白質(zhì)（平均含氮量16%）相比含有更高比例的氮原子，因此被一些造假者利用，添加在食品中以造成食品蛋白質(zhì)含量較高的假象。繼2008年9月國(guó)內(nèi)發(fā)生三鹿奶粉三聚氰胺事件后，伊利雪糕、大白兔奶糖、亨氏米粉、立頓奶茶等奶制品也相繼被檢測(cè)出含有三聚氰胺，嚴(yán)重?fù)p害了國(guó)內(nèi)消費(fèi)者的利益。
本文參考國(guó)標(biāo)GB/T 22388—2008原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法中的樣品提取純化過(guò)程，采用反相離子對(duì)色譜法測(cè)定冰淇淋中三聚氰胺含量，重現(xiàn)性好，靈敏度高。
儀器裝置
本實(shí)驗(yàn)使用島津Prominence LC-20A高效液相色譜儀系統(tǒng)。具體配置為L(zhǎng)C-20AD輸液泵，DGU-20A3在線(xiàn)脫氣機(jī)，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-20AC柱溫箱，SPD-20A紫外可見(jiàn)檢測(cè)器，CBM-20A控制器和LCsolution色譜工作站。
分析方法
色譜柱：Shimadzu VP-ODS 4.6×250 mm 5um
檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm
流動(dòng)相：緩沖液：乙腈=90：10
（緩沖液配制方法：準(zhǔn)確稱(chēng)取2.10 g 檸檬酸和2.16 g 辛烷磺酸鈉，加入約980 mL 水溶解，調(diào)節(jié)pH 至3.0 后，定容至1L 備用）
流速：1 mL/min
柱溫：40℃
進(jìn)樣量：20 μl
洗脫方式：等度洗脫。
樣品前處理方法
參考國(guó)標(biāo)GB/T 22388—2008原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法中的樣品提取純化過(guò)程，具體步驟如圖1所示。
圖1 前處理步驟
分析結(jié)果
1.保留時(shí)間與峰形
圖2為本方法檢測(cè)三聚氰胺標(biāo)樣的典型色譜圖（樣品濃度為0.8 ug/mL）
圖2 三聚氰胺標(biāo)樣圖譜
由圖2可見(jiàn)，本方法所測(cè)三聚氰胺保留時(shí)間為24.40min，峰形尖銳，對(duì)稱(chēng)性好。
2.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)
用流動(dòng)相將三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋得到的濃度為0.8、2、20、40、80 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，濃度由低到高進(jìn)樣檢測(cè)，以峰面積-濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程(見(jiàn)圖3)。
圖3 校準(zhǔn)曲線(xiàn)
結(jié)果表明，該方法線(xiàn)性良好，相關(guān)系數(shù)為0.9999。
3.實(shí)際樣品分析結(jié)果
按本方法測(cè)定兩份冰淇淋樣品(空白樣品和陽(yáng)性樣品)，得到的圖譜分別如圖4和圖5所示，空白樣品在三聚氰胺出峰處無(wú)基質(zhì)干擾。經(jīng)計(jì)算，陽(yáng)性樣品中三聚氰胺的含量為1.40 mg/kg。
圖5 陽(yáng)性樣品檢測(cè)結(jié)果
結(jié)論
本方法具有儀器成本低，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，適用于冰淇淋中三聚氰胺含量的準(zhǔn)確測(cè)定。
聽(tīng)到三聚氰胺，我們?nèi)匀恍挠杏嗉?，不知什么時(shí)候它又會(huì)改頭換面地卷土重來(lái)。我們需要有一雙“火眼金睛”，不給它任何可乘之機(jī)。島津公司的三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀LCMS-8030便是這樣一雙“火眼金睛”。
三聚氰胺(melamine )，簡(jiǎn)稱(chēng)三胺,學(xué)名三氨三嗪，是一種重要的氮雜環(huán)有機(jī)化工原料, 常被用于生產(chǎn)塑料、膠水和阻燃劑。近來(lái)屢見(jiàn)新聞報(bào)道不法分子將含有三聚氰胺的原料用于乳制品生產(chǎn)。由于三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀具有多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）的掃描模式，能夠很好地去除基質(zhì)干擾，因此能夠?qū)ξ⒘康娜矍璋愤M(jìn)行定量檢測(cè)。國(guó)標(biāo)《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法》（GB/T 22388-2008）中規(guī)定了采用LC-MS/MS法測(cè)定乳及乳制品中的三聚氰胺，且該方法的定量限能到0.01 mg/kg。近期，島津公司推出了基于三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀LCMS-8030的奶粉中三聚氰胺檢測(cè)方案。
圖1. 三聚氰胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)式
本檢測(cè)方案建立了一種使用島津三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀LCMS-8030測(cè)定奶粉中三聚氰胺的方法。樣品經(jīng)提取后，用超高效液相色譜LC-30A進(jìn)行分離，三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀LCMS-8030進(jìn)行定性和定量分析。該方法完全滿(mǎn)足國(guó)標(biāo)的要求，校準(zhǔn)曲線(xiàn)的相關(guān)系數(shù)在0.999以上，3個(gè)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液的保留時(shí)間和峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在0.64%和4.34%以下，方法定量限0.005 mg/kg，0.01 mg/kg樣品的加標(biāo)回收率為104.0%。
完全可以滿(mǎn)足乳制品中三聚氰胺檢測(cè)要求的島津LCMS-8030三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀
詳細(xì)內(nèi)容，請(qǐng)咨詢(xún)我司。
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