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老鼠單克隆抗體的糖鏈結(jié)構(gòu)分析

由于在蛋白翻譯后多種酶活動(dòng)，在糖蛋白比如抗體藥物里的糖鏈?zhǔn)亲兓?，糖鏈結(jié)構(gòu)的多變性和非一致性是一個(gè)無(wú)法回避的問(wèn)題。
盡管如此，指導(dǎo)方針還是要求了最大可能限度的糖鏈結(jié)構(gòu)分析。例如，由于巖藻糖（糖鏈的一種分成）的存在與依賴(lài)抗體的細(xì)胞毒性（ADCC）之間關(guān)系已經(jīng)被報(bào)，為了研發(fā)而分析抗體藥物里糖鏈的重要性將會(huì)在未來(lái)繼續(xù)提升。

這是一個(gè)分析商業(yè)化小鼠單抗糖鏈的例子。
 

檢測(cè)、研究流程

1. 根據(jù)染色膠上的抗體，切割SDS-PAGE條帶。
2. 用PNGaseF進(jìn)行膠內(nèi)酶解。
3. 純化糖鏈并用BlotGlyco kit (Sumitomo Bakelite) 氨基吡啶標(biāo)記。
4. Prominence nano/AccuSpot/AXIMA Resonance進(jìn)行MSn分析

結(jié)果

表1顯示了檢測(cè)到的離子m/z值和Prominence nano的洗脫時(shí)間。m/z值用平均質(zhì)量數(shù)來(lái)表示（整數(shù)值）。檢測(cè)到七個(gè)離子：m/z 1418、 m/z 1580、 m/z 1564、 m/z 1726、 m/z 1888、 m/z 2047、和m/z 2209。

表1. 糖鏈衍生離子和檢測(cè)時(shí)間

Fig.1 顯示了m/z 1580和m/z 1726的MS/MS和MS/MS/MS圖譜。預(yù)期的糖鏈結(jié)構(gòu)顯示在圖里。軟件可以輕松地確定巖藻糖的存在，牽涉到ADCC。

除了Fig.1的糖鏈，其他糖鏈的存在也通過(guò)結(jié)構(gòu)確認(rèn)，比如G0-F, G0, G1'-G1', G2, G0+S, 和 G2+S。

因?yàn)檫@個(gè)分析使用了從凝膠上切割下來(lái)的抗體作為起始物，需用Prominence nano/AccuSpot進(jìn)行痕量分析。

Fig. 1 MS/MS 和 MS/MS/MS 譜圖預(yù)測(cè)糖鏈結(jié)構(gòu)

AXIMA Resonance MALDI-TOF MS

• Prominence nano LC 實(shí)現(xiàn)高靈敏度的糖鏈解析。獨(dú)特的逆流控制系統(tǒng)加強(qiáng)了分離重現(xiàn)性，專(zhuān)門(mén)的 Nano-Assist軟件簡(jiǎn)化了自動(dòng)化及參數(shù)設(shè)定。
• AccuSpot 自動(dòng)添加基質(zhì)并將Prominence nano LC分離的糖鏈定位至MALDI靶板。
• Prominence nano分離純化糖鏈混合物可減少由雜質(zhì)引起的離子抑制。
• 分析軟件提供了強(qiáng)大的糖鏈結(jié)構(gòu)解析支持。