基于蛋白質(zhì)相對(duì)比較定量法的大腸癌特異性生物標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)

基于使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記試劑盒(NBS試劑)的相對(duì)比較定量法的大腸癌特異性生物標(biāo)記物

介紹基于使用定量的蛋白質(zhì)解析用穩(wěn)定同位素標(biāo)記試劑盒(NBS試劑：13CNBS® Stable Isotope Labeling Kit-N)的相對(duì)比較定量法的大腸癌特異性生物標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)例。

（實(shí)驗(yàn)·研究流程）

1．從來(lái)自大腸癌患者的大腸正常部位及大腸癌病變部位（各30～50mg）組織提取蛋白質(zhì)，主要分為細(xì)胞質(zhì)中局部存在蛋白質(zhì)的可溶性分離制備和包括細(xì)胞膜中局部存在蛋白質(zhì)在內(nèi)的不溶性分離制備。?！　?br /> 2.對(duì)于來(lái)自正常部位的蛋白質(zhì)使用輕試劑(12C-NBS)、對(duì)于來(lái)自癌部的蛋白質(zhì)使用重試劑(13C-NBS)分別進(jìn)行穩(wěn)定同位素標(biāo)記。
3. 混合標(biāo)記的蛋白質(zhì)樣品，使用胰蛋白酶進(jìn)行酶切，使用納升LC分離得到的肽。 　　
4使用MALDI樣品板用點(diǎn)樣裝置(AccuSpot)，直接將來(lái)自納升LC的洗脫液點(diǎn)制備到MALDI樣品板上。
5.對(duì)于這些上樣在384孔MALDI樣品板上的分離制備的樣品，使用MALDI-TOFMS(AXIMA系列)的自動(dòng)測(cè)定模式進(jìn)行MS測(cè)定。
6.對(duì)于獲得的MS數(shù)據(jù)，使用定量的蛋白質(zhì)解析支援軟件 TWIP進(jìn)行定量解析，選擇變動(dòng)大的應(yīng)關(guān)注的峰。
7.對(duì)于以TWIP選擇的峰進(jìn)一步進(jìn)行MS/MS測(cè)定，通過(guò)Mascot檢索(MS/MS 離子檢索)鑒定蛋白質(zhì)。

（結(jié)果）

對(duì)于使用TWIP檢測(cè)出的具有6Da差的約3000對(duì)峰，從中選擇在70%以上的病例中癌部位/正常部位的峰離子強(qiáng)度比之在±1.5倍以上的峰（320對(duì)），使用Mascot檢索(MS/MS離子檢索)鑒定了差異蛋白質(zhì)。

綜合可溶性分離與不溶性分離檢測(cè)的結(jié)果，對(duì)于大腸癌組織中表達(dá)亢進(jìn)的71種、大腸癌組織中表達(dá)低下的57種共計(jì)128種蛋白質(zhì)進(jìn)行了鑒定。其中，98種蛋白質(zhì)是新鑒定到的與大腸癌相關(guān)的蛋白質(zhì)1)。

圖1：基于免疫印跡解析的表達(dá)變動(dòng)確認(rèn)例　　N : 正常部位 / T : 癌病變部位
 

圖2：基于免疫組織化學(xué)染色的各蛋白質(zhì)在大腸組織中表達(dá)模式的評(píng)價(jià)

對(duì)于檢測(cè)出的標(biāo)記候補(bǔ)蛋白質(zhì)，通過(guò)抗體的免疫印跡解析、免疫組織化學(xué)染色，確認(rèn)/評(píng)價(jià)了使用NBS試劑得到的伴隨癌病變的蛋白質(zhì)表達(dá)變動(dòng)結(jié)果。

圖1表示在癌部位表達(dá)亢進(jìn)的蛋白質(zhì)之一Zyxin的免疫印跡解析結(jié)果。除了Zyxin，Reticulocalbin 1，Galectin-1，Ras related nuclear protein，Vimentin，S-adenosylhomocysteine hydrolase等許多蛋白質(zhì)都獲得了與使用NBS試劑的定量結(jié)果相一致的結(jié)果，驗(yàn)證了使用NBS試劑的定量評(píng)價(jià)的可靠性。并且，通過(guò)免疫組織化學(xué)染色，還評(píng)價(jià)了這些大腸癌上可見(jiàn)表達(dá)亢進(jìn)的標(biāo)記候補(bǔ)蛋白質(zhì)主要是在癌病變組織的哪個(gè)部位上表達(dá)的，確認(rèn)了局部存在于癌細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)亢進(jìn)(圖2)。除本例之外，腎癌也通過(guò)使用NBS試劑的解析鑒定了多個(gè)標(biāo)記候補(bǔ)蛋白質(zhì)2)。

使用NBS試劑的生物標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)在諸如上述使用臨床檢體的解析中也驗(yàn)證了其有效性，對(duì)于疾病特異性生物標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)等生物樣品中的微量標(biāo)記候補(bǔ)蛋白質(zhì)的高靈敏度檢測(cè)卓有成效。

參考資料
1) Watanabe, M., Takemasa, I. et al. (2008). "An application of the 2-nitrobenzenesulfenyl method to proteomic profiling of human colorectal carcinoma: A novel approach for biomarker discovery." Proteomics Clin.Appl.2(6): 925-935.
2) Okamura, N., Masuda, T. et al. (2008). “Quantitative proteomic analysis to discover potential diagnostic markers and therapeutic targets in human renal cell carcinoma.” Proteomics 8: 3194-3203.