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雙特異性抗體（簡(jiǎn)稱(chēng)“雙抗”）是一種新型的抗體藥物，它可以同時(shí)發(fā)揮兩種單抗聯(lián)用的協(xié)同作用，臨床價(jià)值很高，但其質(zhì)量控制的要求也非常嚴(yán)格。在雙抗研發(fā)生產(chǎn)過(guò)程中，需要對(duì)雙抗分子的大小異質(zhì)性進(jìn)行測(cè)定，以確認(rèn)雙抗的連接情況，保障產(chǎn)品質(zhì)量。

然而雙抗分子量的測(cè)定條件中不僅需要使用高濃度的鹽進(jìn)行洗脫，而且紫外檢測(cè)器無(wú)法直接得到分子量，這對(duì)常規(guī)液相系統(tǒng)管路的耐腐蝕性及檢測(cè)器提出了挑戰(zhàn)。

本文采用島津生物惰性液相色譜儀Nexera XS inert搭配多角度光散射檢測(cè)器（MALS）測(cè)定雙抗分子量，為推斷雙抗連接情況提供分析依據(jù)。
 

分析條件

　　流動(dòng)相A：50mM磷酸鹽緩沖液+300mM NaCl（pH=6.8）

　　流動(dòng)相B：乙腈

　　檢測(cè)器1：二極管陣列檢測(cè)器SPD-M40A

　　檢測(cè)器2：多角度光散射檢測(cè)器MALS

　　樣品制備條件及其他分析條件略
 

結(jié)果

MALS需要通過(guò)測(cè)定已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)溶液得到儀器響應(yīng)常數(shù)，圖1是牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液(66500Da)色譜圖，計(jì)算得到MALS響應(yīng)強(qiáng)度為2.9626×10-7，SPD-M40A響應(yīng)強(qiáng)度為8.8552×105。

圖 2為雙抗樣品色譜圖，該樣品為單抗Fc端融合型雙抗，雙抗樣品檢出3個(gè)主要色譜峰，計(jì)算得到峰1、峰2、峰3重均分子量Mw分別為197708Da、145121Da、56401Da，三峰重均分子量與數(shù)均分子量的比值（Mw/Mn）均為1.00，峰2與峰3分子量之和201522Da，與峰1分子量偏差為1.92%，因此推測(cè)出：

　　峰1為雙抗（單抗Fc端融合scFv）

　　峰2為單抗（未融合scFv）

　　峰3為單鏈抗體scFv。

　　雙抗分子量測(cè)定信息見(jiàn)表1。

圖1 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖
 

圖2 雙抗樣品色譜圖
 

表1 雙抗樣品分子量分布

結(jié)論

本文通過(guò)體積排阻色譜法（SEC）聯(lián)合多角度光散射檢測(cè)器（MALS）對(duì)單抗Fc端融合型對(duì)稱(chēng)分子樣品大小異質(zhì)性進(jìn)行分析，SEC根據(jù)分子量大小分離雙抗樣品，MALS檢測(cè)器測(cè)定雙抗樣品分子量，從而推斷雙抗樣品連接情況。此方法簡(jiǎn)單高效、準(zhǔn)確度高，可用于測(cè)定雙抗樣品分子量。

Nexera XS inert生物惰性系統(tǒng)將 UHPLC 系統(tǒng)的高壓耐受性與完全惰性的樣品流路完美結(jié)合，確保沒(méi)有金屬表面的吸附作用，且具有高耐腐蝕性，從而為生物分子的分離提供了理想的解決方案。

 

　 更大限度降低因金屬吸附而造成的損失

　 輕松應(yīng)對(duì)高鹽濃度和極端pH流動(dòng)相的挑戰(zhàn)

　 獲得優(yōu)異的靈敏度、重現(xiàn)性和分離度